作者
玉Ikahihifo-Bender

导师
Caryn Outten博士和夫人艾凡的塔利班战士

文摘

由于其独特的能力作为电子供体和受体,铁是用作辅助因子对许多生物过程,包括电子转移、氧气绑定,和维生素的合成。铁也是一个关键因素在真菌感染人类宿主和病原体侵入争夺有限的铁池。主iron-responsive转录因子Aft1机会致病性酵母菌假丝酵母glabrata对缺铁通过激活铁收购基因的表达。然而,传感细胞内铁含量和调节机制Aft1活动针对铁是未知的。的c . glabrata铁调节系统股票近同源类似系统的非致病性的酵母酿酒酵母,在monothiol glutaredoxins Grx3/4 BolA-like蛋白Bol2形式[2 fe-2s]绑定复合物禁用Aft1铁的条件下。确定一个类似的机制控制c . glabrataAf1活动,我们试图分析在体外从这个酵母病原体Grx4和Bol2之间的相互作用。对于这个项目,我们成功subclonedBOL2基因c . glabrata成大肠杆菌超表达载体允许表达重组Bol2单独或在复杂的伙伴Grx4假定绑定。这里的超表达条件确定将用于未来的实验来净化和描述的结构和铁调节功能与Grx4 Bol2单独或在一个复杂的。

背景

铁是必不可少的营养素,它支持许多细胞过程如氧化磷酸化和新陈代谢,细胞生长和增殖,运输和储存的气体信号分子。^1、2维护优化细胞内铁含量是至关重要的,因为铁缺乏和铁过量都对人体健康有害。¹事实上,缺铁是最常见的营养缺乏在世界上影响了超过十亿人,和铁过载障碍是最常见的常染色体隐性障碍在高加索人群。^1、2体内铁水平也是一个投机取巧的目标病原体与人类宿主。³的个人职业中断固铁对铁和竞争力因此机会病原体的毒性。³假丝酵母glabrata,例如,是一个投机取巧的病原体通常存在于健康的粘膜是candidemia的第二大原因,一种潜在的致命真菌感染的血液中。³

我们的实验室已经使用非致病性真菌酿酒酵母(面包酵母)的实验,研究了结构、功能、和亚细胞定位铁结合蛋白参与铁的交易和监管。^{4 - 6}在这个有机体,iron-responsive转录因子Aft1和Aft2激活铁吸收基因铁耗尽条件。^4、7这些监管机构释放铁的条件下通过绑定一个iron-sulfur (Fe-S)集群。^4、7胞质蛋白Grx3/4和Bol2方便Fe-S集群和Aft1/2之间的绑定。⁴

利用该模型系统的研究划定机制是必不可少的调节体内铁稳态非致病性酵母菌。^{4 - 7}致病性酵母菌c . glabrata可能使用了一个类似的铁监管体系酿酒酵母;⁸然而,关于铁调节的分子机制所知甚少的病原体。延长铁结合蛋白的研究c . glabrata有必要描述铁调控通路,其毒性至关重要。³我们实验室旨在解决这个overexpressing和净化重组Aft1 Grx3/4 Bol2,所以,Aft1的结构及其与目标基因的相互作用和潜在的约束力的合作伙伴可能为特征。Aft1参与铁的监管c . glabrata对这种病原体的毒性至关重要,⁸所以这些发现将改善的理解铁监管如何影响人类对真菌感染的易感性和影响发展的预防或治疗真菌感染的治疗方法。

方法

质粒构建

的BOL2基因放大从10 ng 25 ng, 50 ngc . glabrata基因组DNA(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)的聚合酶链反应(PCR)使用正向和反向引物(表1,欧陆坊基因组学,肯塔基州路易斯维尔市的)。允许的结扎BOL2序列向量骨干,正向引物包含一个5 'Xho我限制性内切酶的网站,和反向引物结合3 'Pac我的网站。PCR反应包括10µL 5 x Q5反应缓冲区,10毫米核苷酸,10µM底漆,10µM反向引物,0.5µL Q5高保真DNA聚合酶,10µL 5 x Q5高GC增强剂,25µL nuclease-free水。PCR进行30周期的熔化温度98°C,退火温度57.3°C,和扩展温度72°C。由于25 s / kb放大Q5高保真的DNA聚合酶和297 - bp PCR产品,扩展温度设定为25。

表1:引物用于放大BOL2从c . glabrata基因克隆到大肠杆菌向量pRSFDuet-1和pRSFDuet-1-Grx4表达式。

正向引物	ctgacgtcggtaccctcgagATGATTACTGAAGAACATCTG
反向引物	ggcagcagcctaggttaattaaTTAAATTACTATCTTTGACCACTC

*小写核苷酸结合pRSFDuet-1和pRSFDuet-1-Grx4向量骨干。

* *大写核苷酸结合BOL2基因。

* * *限制性位点用于克隆BOL2大胆的。

用限制性内切酶PCR产品孵化Dpn我1 h在37°C清理之前确认的产品通过琼脂糖凝胶电泳。剩下的产品组合与向导®SV凝胶净化和PCR清理系统(Promega,麦迪逊,WI)协议。的纯化BOL2片段克隆到pRSFDuet-1 (Novagen,麦迪逊,WI)和pRSFDuet-1-Grx4(大肠的塔利班,c . Outten实验室未发表的数据)来生成pRSFDuet-1-Bol2 pRSFDuet-1-Grx4-Bol2,分别通过双消化Xho我和Pac我限制性内切酶(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA) CutSmart NEBuffer(新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,MA)。pRSFDuet-1和pRSFDuet-1-Grx4向量(1µg)孵化酶的37°C 1 h产生重叠的退火结束BOL2基因;在65°C反应进一步孵化20分钟灭活酶。吉布森大会(GA)协议(新英格兰生物学实验室)是用来绑Bol2插入到消化pRSFDuet-1 pRSFDuet-1-Grx4骨干通过孵化15或30分钟50°C。组装结构被证实与1%琼脂糖凝胶电泳。

pRSFDuet-1-Bol2和pRSFDuet-1-Grx4-Bol2质粒转化成大肠杆菌DH5α细胞与60毫克/毫升磅卡那霉素(菅直人)和孵化一夜之间在37°C。一夜之间,单一的殖民地从每个转换板被种植在5毫升LB-Kan媒体提供四个文化的构建。质粒DNA从使用GeneJET质粒的细胞分离Miniprep工具包(热费希尔科学)。确认组装双消化,pRSFDuet-1-Bol2 pRSFDuet-1-Grx4-Bol2 DNA样本和对应的向量骨干(5µg)与限制性内切酶孵化Bsp你好,囊在37°C I-HF 1 h。质粒DNA样本所对应的矢量控制相比,琼脂糖凝胶电泳。样本殖民地与正确的消化模式被确认通过使用DuetUP2 DNA测序和T7-Term测序引物(Genewiz、研究三角园、数控)。两个确认pRSFDuet-1-Bol2和pRSFDuet-1-Grx4-Bol2 DNA质粒样品变成了大肠杆菌LB-Kan BL21 (DE3)细胞和镀。

为小型超表达最佳测定条件

单一的殖民地都pRSFDuet-1-Bol2 / BL21 (DE3)和pRSFDuet-1-Grx4-Bol2 / BL21 (DE3),小规模文化的殖民地接种磅60毫克/毫升菅直人和生长在37°C。细胞的浓度从每个殖民地被阅读的吸光度检查600海里(OD_600年)。5 h后意想不到的缓慢增长的殖民地,每个文化都有新LB-Kan盘子和孵化一夜之间在37°C,试图再次培养。一个殖民地从每个盘子是LB-Kan接种的媒体和生长在37°C。一个整除non-induced细胞收获之前归纳。后OD_600年对于每一个文化达到了0.6,文化与0.25毫米诱导异丙β-D-thiogalactoside (IPTG) 20°C或30°C 4小时或过夜。一个整除诱导细胞的收获,第二个是治疗细菌蛋白质提取洗涤剂(B-PER热费希尔科学)和离心提取大概可溶性重组蛋白从细胞到上层清液。每个non-induced、诱导和上层清液样本评估使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)。

结果与讨论

质粒构建

放大和结扎的插入

图1:PCR扩增的BOL2从c . glabrata基因组DNA。琼脂糖凝胶(1%)与5-µL样品PCR反应的产品包含10 ng, 25 ng, 50 ngc . glabrata基因组DNA;箭头表示预期的大小BOL2片段。第一列是一个DNA梯片段的大小表示。

的BOL2基因被放大c . glabrata使用PCR基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳(图1)显示了乐队在297个基点的预期大小表明放大的BOL2为每个基因组DNA的浓度是成功的。

遗传算法是利用结扎BOL2插入到pRSFDuet-1和pRSFDuet-1-Grx4向量脊椎形成转型为宿主细胞表达质粒。PCR产品与限制性内切酶消化Dpn然后我删除模板DNA甲基化进一步纯化分离BOL2。结果与小RNA片段是高质量DNA污染的260 nm / 280 nm指数为1.86。

成功的限制性内切酶的网站BOL2和双向量脊椎的消化Xho我和Pac我允许重叠结扎的结束。质粒转化成大肠杆菌DH5α导致扩增的DNA重组Miniprep隔离。

确认组装与向量的骨干

图2:BspHI和SacI-HF双消化确认pRSFDuet-1-Bol2 (A)和pRSFDuet-1-Grx4-Bol2 (B) .琼脂糖凝胶(1%),显示成功的双质粒的消化和骨干作为控制各自的向量。V = pRSFDuet-1向量(A)或pRSFDuet-1-Grx4向量(B)。数字1 - 4表示各个殖民地的质粒DNA分离。

装配完整的表达向量pRSFDuet-1-Bol2和pRSFDuet-1-Grx4-Bol2证实了双消化Bsp你好,囊I-HF。琼脂糖凝胶电泳对限制消化pRSFDuet-1-Bol2(图2)表明793 - bp所有殖民地表示连接成功的乐队BOL2pRSFDuet-1向量;pRSFDuet-1向量是错过了BOL2基因的短607 - bp乐队。琼脂糖凝胶电泳对限制消化pRSFDuet-1-Grx4-Bol2(图2 b)显示了殖民地1031 - bp乐队1 - 3表明成功的结扎BOL2pRSFDuet-1-Grx4向量;pRSFDuet-Grx4向量是错过了BOL2基因的短845 - bp乐队。前乐队(图2)是未消化的质粒DNA控制缺乏进一步的说明BOL2插入和短。结构转型为前经DNA测序大肠杆菌BL21 (DE3)蛋白表达。

为小型超表达最佳测定条件

图3:(一)表达重组Bol2(预计MW = 9.5 kD)。sds - page凝胶比较Bol2蛋白表达与0.25毫米IPTG诱导后两个间隔两个温度和增长。(B) Co-expression Bol2和Grx4(预计MW = 29.8 kD)。sds - page凝胶比较Bol2和Grx4 co-expression与相同的感应和生长条件(A)。梯子分子量的大小标准(兆瓦;kD)的左边列出每个凝胶。L =梯子,N = non-induced细胞,I =诱导细胞,和S =上层清液。

小规模文化与pRSFDuet-1-Bol2和pRSFDuet-1-Grx4-Bol2接种大肠杆菌BL21 (DE3)主机应变与0.25毫米IPTG诱导和生长为4小时或隔夜20°C或30°C。与0.25毫米IPTG诱导是基于最优条件期间,我们实验室发现的Aft1表达研究c . glabrata(大肠的塔利班,c . Outten实验室未公开的数据)。增长30°C而不是最优大肠杆菌增长温度(37°C)已经推荐了可溶性蛋白的表达在宠物向量系统避免积累夹杂物的身体。^{9 - 10}增长20°C和适应与隔夜孵化也被推荐用于可溶性蛋白的表达。^{9 - 10}而在一夜之间蛋白质降解条件是可能的,这些建议的条件下较低的温度和长期增长可能允许更好的可溶性蛋白质的折叠和利用已成功表达重组Aft2, Bol2, Grx3/4酿酒酵母。^{4 - 6、9 - 11}

sds - page凝胶电泳的细胞是从文化pRSFDuet-1-Bol2 / BL21 (DE3)和pRSFDuet-1-Grx4-Bol2 / BL21 (DE3)(图3)描绘了一个乐队在诱导~ 11 kD样本中没有non-induced样本表明Bol2成功表达了与IPTG诱导后独自和Grx4的存在。预期的Bol2 9.5 MW kD;然而,在我们的凝胶Bol2始终运行在11 ~ kD(图3)。这种异常迁移可能是由于蛋白质的转录后修饰或酸性残基干涉SDS绑定在SDS - page。值得注意的是,Bol2直接同源从其他生物也在兆瓦高于预期。^5、6不管这缓慢的迁移趋势,non-induced之间的表达模式和诱导条件强烈表明,这是正确的乐队。蛋白质质谱分析和尺寸排阻色谱法将用于未来评估Bol2的大小c . glabrata更准确。

11-kD诱导乐队4 h增长30°C(图3)看起来更清晰和更强烈的比其他的乐队感兴趣的支持,优化表达条件检测Bol2独自与0.25毫米IPTG诱导随后增长4 h在30°C。sds - page凝胶电泳的细胞是从文化pRSFDuet-1-Grx4-Bol2 / BL21 (DE3)(图3 b)描绘了一个乐队在~ 26 kD独特的诱导样品复杂构造和缺席non-induced样本表明Grx4成功表达的Bol2后用IPTG诱导。11-kD和26-kD诱导乐队4 h增长30°C(图3 b)比其他乐队显得更清晰和更强烈的兴趣表明最优条件检测Bol2和Grx4 co-expression也与0.25毫米IPTG诱导随后增长4 h在30°C。11-kD乐队(图3)的强度仅为Bol2一致而在Grx4表明Grx4 co-expression并不妨碍Bol2表达式。

在未来,我们将这些条件适用于大规模表达研究Bol2 Grx4和潜在的约束力的合作伙伴c . glabrata。我们还将确认这些蛋白质的身份(图3)和质谱分析以及净化他们以前描述的协议的酿酒酵母同源染色体。⁵

结论

我们的研究结果表明,BolA-like蛋白质Bol2c . glabrata成功重组在吗大肠杆菌单独和的存在monothiol glutaredoxin Grx4。Bol2孤独的最佳条件表达式和中的Grx4被发现与0.25毫米IPTG诱导其次是孵化4 h 30°C。Bol2 Grx4需要净化,使用在未来的交互研究这些绑定合作伙伴和iron-responsive转录因子Aft1c . glabrata。紫外可见吸收、圆二色性和电子顺磁共振光谱将利用集群研究Fe-S绑定Grx4特点和Bol2 Aft1的存在与否。描述这些特征将进一步阐明Fe-S集群在铁调节的作用c . glabrata并指出如何监管在这种真菌病原体比较的非致病性的酵母酿酒酵母。

关于作者

玉Ikahihifo-Bender

我是一个高级的南卡罗来纳大学毕业2021年bob官方体育登陆5月与生物化学和分子生物学学士学位和辅修心理学。从锚地后,阿拉斯加,桃金娘海滩,南卡罗来纳,我发现巨大的支持我的学习和研究项目在南卡罗莱纳大学的卡罗莱纳州学者和科学本科研究奖学金的赞助对象和麦哲伦学者奖。bob官方体育登陆这个项目吸引了我,因为它对铁调节紊乱的药物和疗法的发展以及真菌感染。我的研究在南加州大学的经历鼓励我追求实习在国家过敏和传染病研究所的杰弗里•科恩博士的我在实验室工作和扩大我的兴趣研究的意义。毕业后,我希望能从事临床研究或医疗制造更多地了解医疗之前申请医学院的复杂性。

这项工作是一个项目的延伸,以前在独立的研究中,发现南加州大学2019年毕业与领导研究的区别。它也将被包括在我的荣誉毕业论文和发现南加州大学2021。我想延长我的感谢Caryn Outten博士在化学和生物化学的部门工作的机会在她的实验室五个学期,她的指导。埃文太太的塔利班方面在我的生长和项目进展与她的指导和坚定的鼓励。我还想感谢c . Outten实验室集团作为一个整体的支持。

这项工作是由国家一般医学科学研究所的R01 (GM100069授予首席执行官),SC研究基金会,SCHC科学本科研究奖学金授予和UofSC麦哲伦学者奖。

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